生物退浆酶的检测方法

退浆酶的主要成分就是α—淀粉酶.我找了一种α—淀粉酶的检测方法.

α—耐高温淀粉酶 分光光度计法

1 原理：

α-淀粉酶能将淀粉链子中的α—1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝黑色的特异性反应，随淀粉降解蓝色逐渐减褪，渐变成红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关，故可在标准条件下，通过测定反应后溶液的吸光度计算其酶活力

2 试剂和溶液

1)原碘液：称取碘化钾22.0g溶于约300mL水中，加入碘11.0g,在搅拌下使其溶解，然后移入500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(每月制备一次)。

2)稀碘液：称取碘化钾20.0g溶于300mL水中，准确加入原碘液2.00mL，全部移入500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(须当天配制)。

3)20g/L可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉(以绝干计)2.000g,精确至0.0001g,用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中,然后，以30mL水分几次冲洗盛淀粉的小烧杯，洗液并入其中,加热煮沸2min直至完全透明，冷却至室温，全部移入100mL容量瓶，用水稀释至刻线。此溶液必须当天配制。

4)磷酸缓冲液(PH=6.0)：称取磷酸氢二钠45.23g、柠檬酸8.07g，用水溶解并定容至1000mL.配好后,用PH计校正。

5)盐酸溶液c(HCL)=0.1mol/L.

3 仪器和设备：

a）分光光度计 b）恒温水浴50℃-100℃,精度±0.1℃ c）试管:25mm×200mm d）容量瓶 e）自动吸管 f）秒表

4 待测酶液的制备

液体酶制剂:直接用缓冲溶液配制,使最终浓度控制在65-70u/mL范围内。

5 测定

1)吸取可溶性淀粉溶液20.0mL和缓冲溶液5.0毫升于试管中，在70℃恒温水浴中预热平衡5min。

2)加入稀释好的待测酶液1.00mL,立即用秒表记录时间,摇匀,准确反应5min。

3)立即用吸管吸取反应液b)1.00mL,加到预先盛有0.1mol/L盐酸0.5mL和稀碘液5.00mL的试管中，摇匀。

4)以0.1mol/L盐酸0.5mL和稀碘液5.00mL的混合液作试剂空白,于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定吸光度(A).根据吸光度查附录A(标准的附录),求得测度酶液的浓度(c)。

6 酶活力定义:

在70℃PH6.0的条件下,1分钟液化1mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量,即为一个酶活力单位,以u/mL(u/g)表示。

7 计算: X=c×n×16.67

式中X------样品的酶活力

c------测试酶的浓度

n------样品的稀释倍数

16.67—换算常数

所得结果表示至整数.

8 结果的允许差

平行试验相对误差不超过2%。