分子标记技术在甜瓜上有哪些应用?

分子标记是基于生物遗传物质——DNA的多态性的遗传标记。目前,广泛应用的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SCAR、ISSR等。这些标记已广泛应用于甜瓜遗传育种研究的多个领域,包括遗传图谱构建、遗传多样性分析、物种和品种起源、分类与进化、基因定位、品种指纹构建、品种或杂种纯度鉴定、辅助育种、跟踪杂种后代遗传物质的遗传动态、质量和数量性状基因位点分析等,显示出巨大的应用潜力。

(一)品种亲缘关系的分析和分类

长期以来,甜瓜品种的亲缘关系分析和分类主要采用形态指标,这些指标易受环境影响而发生变化,从而影响亲缘关系判断和分类地位确定的准确性。一些形态指标相近或形态标记较少的品种(类型)难以区分。分子标记技术的应用可以在较大范围内综合比较甜瓜的遗传物质,包括检测和鉴定DNA非编码区的变异,比传统方法更全面地反映其遗传多样性,为分子水平的分类提供客观依据。Neuhausen等人(1992)利用RFLP技术对甜瓜的遗传多样性进行了研究,在分子水平上对44份材料进行了分类,但在甜瓜和蜜瓜中很少有多态性分子标记。徐勇(1999)研究了RAPD的甜瓜起源和分类,结果支持“多源说”。同时,分子标记的聚类结果也支持网纹甜瓜可以单独划分为一个厚皮甜瓜品种的结论。刘万波等(2002)研究了ISSR和RAPD的37个甜瓜品种的遗传多样性。根据两个标记的结果,供试材料分为野生甜瓜和栽培甜瓜两大类。两个分子标记的分析结果呈正相关(r = 0.62 > r = 0.01)。野生甜瓜种质间的遗传距离较大,与其分类地位基本一致。从已有的甜瓜分子标记研究来看,甜瓜品种间的分子标记多态性高于西瓜,这与甜瓜复杂的遗传基础相一致。金基石(2001)等人利用RAPD技术对22份薄皮甜瓜材料进行分析,结果与这一结果一致。

必须指出,分子标记技术在甜瓜品种亲缘关系分析和分类中的准确性和可靠性取决于所用材料的代表性和分子标记在基因组检测中的深度,还必须与形态学分析相结合。只有这样,才能得到更全面、更科学的结果。

(2)鉴定第一代杂种的纯度

DNA标记技术鉴定一代杂种纯度的基本原理是判断目标品种的DNA图谱中是否出现特定的DNA条带。也就是说,要求选择出现在目标品种DNA图谱中,而没有出现在其他品种中的DNA条带作为鉴定其纯度的特异条带。通过F1代与其亲本的特征条带比较,有可能实现杂种纯度的室内快速鉴定。陆璐羽毛球等(2005)利用SSR标记鉴定了两个甜瓜杂交种(系)东方蜜1和01-31及其亲本。从23对SSR引物中筛选出8对引物,分别扩增出两个甜瓜杂种与其亲本间的多态性。说明每个杂交组合的父本和母本都放大了自己的特征条带,而他们的杂种出现了双亲的两个特征条带,显示了双亲的互补带模式,因此可以准确地区分真假杂种。随后,利用SSR引物M6和M18分别对东方蜜1和01-31的100粒种子进行纯度鉴定,测得的杂交率与田间种植鉴定结果完全一致。表明SSR标记技术可以应用于甜瓜杂交种纯度的室内快速检测。

分子标记技术在作物品种鉴定中的应用具有重要的理论和实践价值。根据各品种指纹图谱的差异,可以判断品种间的亲缘关系。测定品种间的遗传距离和系谱分析,可以指导科学配制杂交组合,减少育种的盲目性。同时,品种的指纹具有很强的个体特异性,甚至可以检测到基因组中很小的变异,符合品种鉴定技术应该具备的基本标准,如环境稳定性、品种间变异的可识别性、品种内变异最小、实验结果的可靠性等。与早期形态学标记鉴定相比,具有简单、快速的优点。此外,保护名、优、特种质和育成品种的知识产权,维护育种者权益具有重要意义。但总的来说,这些研究成果还处于积累阶段,离实际应用还有一段距离,还需要更深入细致的研究。

(3)甜瓜遗传图谱的构建及相关基因的标记和定位。

甜瓜分子遗传图谱的构建极大地方便了甜瓜育种的研究,为相关基因的分离和克隆奠定了基础。目前,已经利用分子标记构建了一些甜瓜品种的遗传图谱,并在相应的图谱中定位了一些抗病基因或与之紧密连锁的分子标记。从65438到0996,Baudracco-Arnas和Pitrat利用AFLP和RAPD技术建立了甜瓜的遗传图谱。2002年,Anin-Poleg构建了甜瓜P1414723的遗传图谱,并在该图谱中定位了西葫芦黄花叶病毒ZYMV的抗性基因。2003年,Silberstein等人利用RAPD、SSR和AFLP技术建立了甜瓜的连锁图谱(P1414723),该图谱包含了与抗蚜表型、性别性状表型和种皮颜色表型相关的基因的分子标记。Wechter等(1995)在甜瓜抗病材料MR-1上获得了一个与尖孢镰孢菌小种1连锁的RAPD标记,并成功将其转化为SCAR标记。2000年,王等利用MR-1与感病品种AY杂交,建立了F2代分离群体。利用AFLP和RAPD技术,获得了与甜瓜0号生理小种和1号生理小种的抗病基因Fom-2连锁的15个分子标记,Fom-2基因定位在Mr-1K..郑等(2001)也报道了与甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2连锁的三个标记E07、G17和G596。E07和G17是感病状态的连锁标记,存在于许多感病品种中。最近,Yael等(2002)在甜瓜中发现了与抗ZYMV病毒基因Zym-1紧密连锁的SSR标记CMAG36,遗传距离为9.1cm;。与甜瓜0号和2号小种抗枯萎病基因Fom-1连锁的SSR标记CMTC47的遗传距离为17.0cM

除了甜瓜抗病基因标记外,还研究了控制甜瓜重要性状的其他基因标记。李秀秀(500bp)研究了两性花和雌雄异株甜瓜材料杂交后代和回交后代的花型分离,表明F2群体中的一夫一妻制花性状受单显性基因控制,按3: 1的比例分离,进一步证明了两性花和雌雄异株甜瓜材料的基因型分别为aaGG和AAGG,并利用RAPD技术在F2群体中进行混合分组分析。

虽然已经在甜瓜中发现了许多与主基因连锁的分子标记,但通过分子标记辅助技术将有可能选育出更多的甜瓜新品种。但实际上,大部分研究还停留在标记识别、定位、测绘等基础环节。通过分子标记辅助选择,提高育种效率,大规模培育优良品系或品种的期望远未实现。目前甜瓜遗传图谱中的一些分子标记不能用于不同的遗传图谱,还没有建立起比较完善的具有普遍参考意义的甜瓜遗传图谱。

(D)分子标记辅助选择

主基因抗性的标记辅助选择方法越来越受到重视。MAS是指通过选择一个与目标基因紧密连锁的标记(或两端两个标记)来选择一个或多个抗性基因。标记辅助选择不受环境条件的限制,可以实现早期选择,节省接种试验和田间批量试验,缩短育种周期,从而提高选择的有效性。然而,分子标记辅助育种在甜瓜上还没有取得很大进展。主要原因是分子标记鉴定和辅助育种这两个重要环节在以往的研究中没有得到整合。大多数研究人员只是以识别重要标记为目标,而没有将标记辅助育种纳入自己的工作目标。因此,他们在设计寻找标记的研究方案时,往往只考虑鉴定标记的可行性,而不从直接培育新的优良品系或品种的目标出发,考虑初始亲本的选择,因此在获得标记时只能提供育种的中间种质材料。另一方面,分子标记的鉴定技术和辅助选择技术体系需要进一步改进和完善。识别控制品质性状的单个基因或少数基因在技术上是可行的,但由于产量和品质等大多数重要园艺性状都是由多个基因控制的数量性状,识别和准确定位它们不仅成本高、周期长,而且技术上也很困难,因此仍需进一步研究。