不对称引物的应用？
不对称PCR扩增方法、专用引物及其应用
申请专利号为CN200410056866.0。
专利申请日期:2004年8月26日
一种不对称PCR扩增方法及其专用引物和应用
公布(公告)号CN1629305
出版日期(公告)2005年6月22日
类别化学；冶金学
认证日期
优先权
申请(专利权)北京博奥生物芯片有限公司；清华大学
地址102206北京市昌平区生命科学园路18号
发明家(设计师)张志伟；王伟；朱令翔；张琼；景程
国际申请
国际公告
入境日期
专利代理北京吉凯知识产权代理有限公司
关畅探员
摘要
本发明公开了一种不对称PCR扩增方法及其专用引物和应用，旨在提供一种能够简单高效制备单链扩增产物的PCR扩增方法。本发明提供的不对称PCR引物，包括多对PCR引物对，其特征在于，在每对引物中的一对引物的5’端添加一段与待扩增的靶序列无关的寡核苷酸尾。本发明提供的不对称PCR扩增方法包括以下步骤:1)预变性；PCR扩增的第一部分，包括几个变性、引物退火和引物延伸循环；PCR扩增的第二部分，包括几个变性和引物延伸循环。在用于引物延伸的PCR引物对中的一个引物的5’末端添加一段与待扩增的靶序列无关的寡核苷酸尾。本发明的不对称PCR扩增方法单链产率高，可进行单或多重PCR扩增，可广泛用于核酸检测。
主权术语
1.一种不对称PCR引物，包括几对PCR引物对，其特征在于在每对引物中的一个引物的5’末端添加一段与待扩增的靶序列无关的寡核苷酸尾。
PCR产物的直接测序
PCR扩增靶序列的凝胶纯化
如果最佳的PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可以用新的寡核苷酸重新扩增，或者用凝胶电泳分离不同的PCR产物，然后将每个PCR产物重新扩增进行序列分析。不同长度的片段可以通过琼脂糖凝胶电泳分离:
1.当片段大小为80-100bp时，可用3%NuSieve1%普通琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
2.从胶上切下含有来自南非的PCR片段的切片。
3.加入50∽100μlTE浸泡薄膜，可反复冷冻或放置数小时，使DNA从胶中扩散出来。
4.取少量(1-5%)进行第二次扩增。为了获得纯的单一产物，用于第二次PCR扩增的凝胶提取物的量必须小于65438±0 ng。
5.已经发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活性的物质。所以，如果需要重新扩增片段进行Tab聚合酶测序，最好用丙烯酰胺电泳分离。
当使用PCR引物扩增几个长度相同的相关序列时，如来自几个新复制的基因、重复序列或保守信号序列的同一引物，可以通过以下两种不同的方法改善电泳分离。1).首先用核酸内切酶只切割一个模板，然后用电泳纯化完整的PCR产物。2)用于分离具有不同核苷酸序列的扩增产物的电泳系统。下一节将讨论这类体系中的变性甲酰胺梯度凝胶体系。就目前而言，需要预先知道不同PCR产物中的内切酶位点。
杂种的直接测序
当两个等位基因由于单个位点突变而不同时，杂合位点可以通过用PCR引物直接测序来发现。然而，具有几个点突变或插入/缺失短片段的等位基因模板将直接用一个PC R引物测序，这将产生复合测序梯。确定几种隆起，从杂合子中获取单个等位基因的序列有四种方法:1)。克隆和分离不同的模板；2)测序前，利用模板间核苷酸序列的差异，通过电泳技术分离不同的模板；3)测序反应中只有一个等位基因启动；4).只有一个等位基因被扩增。
测序模板的制备
与PCR产物直接测序相关的一些问题是，变性后，扩增片段的两条链可以快速结合，从而阻止测序引物与其互补序列退火或阻止引物-模板复合物的延伸。在测序反应中，模板链重组使小部分模块分析测序，从而削弱最终测序条带。为了减少这个问题，可以通过改进的标准双链DNA测序或PCR来制备单链模板。
双链DNA模板
有两种不同的方法来制备用于测序的模板，并且这两种方法都已经被用于确定化合价为* * *的闭环双链质粒模板的序列。用这些方法通常很难对PCR产物进行测序，因为短的线性模板比双链质粒更容易重组。在这两种方法中，PCR片段可以在电泳前通过凝胶电泳或旋转透析来纯化。
1.室温下，模板在0.2M NaOH中变性5Min，冷冻，加入0.4倍的5m乙酸铵(pH7.5)中和反应。立即用四倍体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下加入测序缓冲引物。
2.将温度保持在95℃5分钟以使模板变性，并在冰浴(或干冰乙醇)中快速冷却离心管以减少链的重组。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物适合在变性之前或之后加入。
单链DNA模板
使用单链模板可以避免测序中的链重组。单链模板可以通过链分离凝胶或PCR反应从双链DNA模板制备。大于500bp的单链DNA片段可以从琼脂糖凝胶中分离出来，但不适用于较短的单链。另一种制备单链DNA的不同方法是在PCR反应中使用生物素标记的引物。变性的PCR产物通过抗生物素蛋白柱分离两条链，只有生物素标记的链可以结合到柱上。然而，最简单的方法是使用改进的PCR方法制备已建立的单链DNA。在这个反应(不对称PCR，asymmetric PCR)中，前20-25个循环中，两个比例不对称的扩增引物产生双链DNA，当限制性引物用完时，随后的5-10个循环产生ssDNA。大约25个循环后开始出现单链DNA，有限的引物数量几乎耗尽。经过短暂而快速的上升后，ssDNA如预期的那样开始线性积累，当时反应中只存在一个引物。不同比例的引物产生这种形式的ssDNA。一般来说，对于100μlPCR的反应体系，引物配比为50pmo:0.5pmol，30次循环后可产生约1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可以通过以下方法估算:a)。在PCR反应中，除了正常量的dDNA之外，还加入32P-dNTP。将10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与薄膜一起曝光。b)。取5%反应物凝胶化，转移到膜上，以与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。SsDNA不能通过EB染色定量，因为ssDNA倾向于形成二级结构，并且染料在模板中的插入是随机的。不对称引物比例的扩增效率低于(70%)80-90%过量的两种引物。在实验中，这可以通过增加PCR循环的次数来补偿。如果不对称PCR反应不能产生足够的ssDNA，我们可以尝试不同的引物比例。b)增加5-10个PCR循环；c)在最后五个循环中加入更多的Tab聚合酶(2U );d)。尝试相反的不对称引物比例。有时，相反的不对称引物比例可能产生不同的ssDNA产量。用有限数量的PCR引物或内部引物对制备的单链DNA进行测序，通过常规方法进行掺入测序或标记引物测序。制备的ssDNA链可能具有不连续的5’-末端，但它可能在3’-末端附近的不同位点被切断，这是由于延伸过程中过早终止造成的。然而，对于测序反应中使用的任何引物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。
最近，报道了另一种制备用于直接测序的单链核酸模板的方法。该方法包括在PCR引物中加入噬菌体启动子，转录PCR产物的RNA拷贝，然后使用逆转录酶而不测序。然而，由于在扩增反应后增加了酶促反应步骤以及使用逆转录酶作为测序酶的限制，该方法的应用受到了极大的限制。
双链DNA模板
有两种不同的方法来制备用于测序的模板，并且这两种方法都已经被用于确定化合价为* * *的闭环双链质粒模板的序列。用这些方法通常很难对PCR产物进行测序，因为短的线性模板比双链质粒更容易重组。在这两种方法中，PCR片段可以在电泳前通过凝胶电泳或旋转透析来纯化。
1.室温下，模板在0.2M NaOH中变性5Min，冷冻，加入0.4倍的5m乙酸铵(pH7.5)中和反应。立即用四倍体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下加入测序缓冲引物。
2.将温度保持在95℃5分钟以使模板变性，并在冰浴(或干冰乙醇)中快速冷却离心管以减少链的重组。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物适合在变性之前或之后加入。
单链DNA模板
使用单链模板可以避免测序中的链重组。单链模板可以通过链分离凝胶或PCR反应从双链DNA模板制备。大于500bp的单链DNA片段可以从琼脂糖凝胶中分离出来，但不适用于较短的单链。另一种制备单链DNA的不同方法是在PCR反应中使用生物素标记的引物。变性的PCR产物通过抗生物素蛋白柱分离两条链，只有生物素标记的链可以结合到柱上。然而，最简单的方法是使用改进的PCR方法制备已建立的单链DNA。在这个反应(不对称PCR，asymmetric PCR)中，前20-25个循环中，两个比例不对称的扩增引物产生双链DNA，当限制性引物用完时，随后的5-10个循环产生ssDNA。大约25个循环后开始出现单链DNA，有限的引物数量几乎耗尽。经过短暂而快速的上升后，ssDNA如预期的那样开始线性积累，当时反应中只存在一个引物。不同比例的引物产生这种形式的ssDNA。一般来说，对于100μlPCR的反应体系，引物配比为50pmo:0.5pmol，30次循环后可产生约1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可以通过以下方法估算:a)。在PCR反应中，除了正常量的dDNA之外，还加入32P-dNTP。将10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与薄膜一起曝光。b)。取5%反应物凝胶化，转移到膜上，以与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。SsDNA不能通过EB染色定量，因为ssDNA倾向于形成二级结构，并且染料在模板中的插入是随机的。不对称引物比例的扩增效率低于(70%)80-90%过量的两种引物。在实验中，这可以通过增加PCR循环的次数来补偿。如果不对称PCR反应不能产生足够的ssDNA，我们可以尝试不同的引物比例。b)增加5-10个PCR循环；c)在最后五个循环中加入更多的Tab聚合酶(2U );d)。尝试相反的不对称引物比例。有时，相反的不对称引物比例可能产生不同的ssDNA产量。用有限数量的PCR引物或内部引物对制备的单链DNA进行测序，通过常规方法进行掺入测序或标记引物测序。制备的ssDNA链可能具有不连续的5’-末端，但它可能在3’-末端附近的不同位点被切断，这是由于延伸过程中过早终止造成的。然而，对于测序反应中使用的任何引物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。
最近，报道了另一种制备用于直接测序的单链核酸模板的方法。该方法包括在PCR引物中加入噬菌体启动子，转录PCR产物的RNA拷贝，然后使用逆转录酶而不测序。然而，由于在扩增反应后增加了酶促反应步骤以及使用逆转录酶作为测序酶的限制，该方法的应用受到了极大的限制。