反硝化细菌主要用于处理怎样的水质问题
摘要
本发明公开了一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用，申请人通过富集从湿地中筛选出一种好氧反硝化细菌，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，CCTCC NO：M2013488。该细菌可用于处理高NO3-的废水，最高去除率可达99.6%，且无亚硝态氮的累积，并可同时去除有机废水中的COD，去除率可达60%-80%。相比其他报道的用于污水处理的好氧反硝化细菌，本发明菌株对污水处理高效，24h后对硝态氮的去除率可达99.6%，脱氮速率可达22.6mg?L-1?h-1，其除氮效率是已报道菌株的1.51～4.57倍，可以单独使用或者固定化后应用于废水处理中，应用广泛。
权利要求书
1.一种好氧反硝化细菌，其特征在于：施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，CCTCC NO：M 2013488。
2.权利要求1所述的好氧反硝化细菌在污水处理中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该好氧反硝化细菌用海藻酸钠进行固定。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该好氧反硝化细菌用聚乙烯醇进行固定。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该好氧反硝化细菌用海藻酸钠和聚乙烯醇进行固定。
说明书
一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种好氧反硝化细菌，还涉及该细菌在污水处理 中的应用。
背景技术
近年来，工业废水的大量排放以及农业大量施用化肥，导致氮素污染引起的水环境问题 日益突出，而其中硝酸盐污染问题尤为严重。硝酸盐及其衍生物因具有致病、致癌作用而影 响人类健康。因此，加大对污水中氮素污染的治理，尤其是提高硝酸盐氮的处理效率是目前 污水处理技术中亟待解决的问题。
生物反硝化脱氮是利用微生物的作用，在厌氧或缺氧条件下，以硝酸盐替代氧作电子受 体将硝酸盐逐步还原为气态产物脱除，是一种经济有效的脱氮方式。但往往由于受到厌氧和 缺氧条件的限制，生物脱氮过程进行的并不彻底。好氧反硝化菌的出现使得反硝化过程更容 易控制，其是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化细菌。 自20世纪80年代，Robertson等(Robertson et al.Archives of Microbiology,1984,139,351-354) 在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌以来，人们对于好氧反硝化菌的脱氮性 能已经进行了一定程度上的研究。然而已筛得的好氧反硝化菌大部分脱氮效率不高，一般在 溶解氧浓度较低时才会具有反硝化活性，因此，筛选分离出高效的好氧反硝化细菌菌株，并 将其应用于实际污水处理中，以节约脱氮成本，提高经济效益具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株好氧反硝化细菌，该细菌已于2013年10月23日送往中国 典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，保 藏编号：CCTCC NO：M2013488。该菌株具有高效脱除水体中硝酸盐氮的能力。
本发明的另一个目的在于提供了一株好氧反硝化细菌在污水处理中的应用，单独使用该 菌，或者将该菌进行固定化后投放到水体中，均可以有效地去除水体中的硝酸盐氮，且无亚 硝态氮的累积，并且除氮速度快。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种好氧反硝化细菌，其筛选过程是：
(1)富集
于2013年5月从增氧型复合垂直流人工湿地小试系统两套系统中采集土壤样品，采样 深度为表层10cm。无菌条件下称量10g土壤接入500mL的液体培养基中进行富集，利用间 歇曝气法进行富集，间歇时间为12h，每次曝气3h，于30℃温箱培养，每五天转接一次， 富集时间1个月。测得硝态氮的去除率为99.9%，基本上没有亚硝氮的累积。
所述液体培养基为KNO32g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.2g，柠檬酸 钠5g，微量盐溶液2mL;蒸馏水1000mL。
(2)初筛
采用涂布法将富集得到的菌悬液均匀涂布于BTB选择性培养基，30℃温箱培养3d后， 选取变蓝的菌落或晕圈作为初筛菌。
(3)复筛
将初筛的菌株接种于液体培养基，30℃，120r·min-1摇床培养5d，进行复筛。每24小 时利用格氏试剂、二苯胺试剂显色来检测硝酸盐的降解情况，选取去除效果好的菌株。
所述BTB培养基为：琼脂20g，KNO31g，KH2PO41g，FeCl2·6H2O0.5g，CaCl2·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O1g，琥珀酸钠8.5g，BTB(1%溶于酒精)1mL;蒸馏水1000mL，用 1mol·L-1NaOH调节pH至7.0～7.3。
通过综合比较硝态氮的去除率，亚硝态氮的累积量以及硝态氮的去除速率等指标，最终 从28株初筛菌中筛选出一株好氧反硝化细菌JH-1，其16SrRNA为SEQ ID NO.1所示。该 细菌已于2013年10月23日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：施氏假单 胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，保藏编号：CCTCC NO：M2013488，地址：中国武汉 武汉大学。
JH-1为革兰氏阴性菌，为短杆菌，长为1.0um—1.5um,宽为0.2um—0,4um,无芽孢和鞭 毛，在固体培养基上形成不透明的白色菌落，菌落表面光滑，边缘整齐。
JH-1生理生化特性–酶活、碳源同化
+：阳性，-：阴性，
JH-1生理生化特性--酶活
+：阳性反应;-：阴性反应;W：弱阳性反应
一种好氧反硝化细菌在污水处理中的应用，其步骤是：
(1)将活化后的菌液接种于待处理的含氮废水中，投加量为受处理废水体积的5%，pH 范围为7.0-7.3，在摇床(30℃，120r/min)条件下，定时取样检测水样中硝态氮、COD的 去除率及亚硝态氮的累积量。
(2)用三种不同的基质包埋细菌获得固定化好氧反硝化细菌，并用于废水脱氮处理中
A、海藻酸钠固定法：称取4g海藻酸钠溶解到60mL的0.9%的生理盐水中，高温高压 (121℃，105-110kPa)灭菌冷却至室温(20-25℃)，与80mL好氧反硝化细菌悬浮液充分混 合，滴入4%w/v的CaCl2溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球;将形 成的小球放置于4℃冰箱中交联固化12-24h后，用生理盐水洗涤2-3次备用。
B、聚乙烯醇固定法：配制60mL10%w/v的聚乙烯醇溶液，高温高压(121℃，105-110kPa) 灭菌冷却到室温(20-25℃)，与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合，滴入饱和硼酸溶液中， 冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球;将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固 化12-24h后，用生理盐水洗涤2-3次备用。
C、海藻酸钠和聚乙烯醇固定法：5%w/v聚乙烯醇和5%w/v的海藻酸钠的混合溶液60mL， 加热使其完全混合，高温高压灭菌(121℃，105-110kPa)，冷却至室温(20-25℃)，与80mL 好氧反硝化菌悬液充分混合;将此混合液用注射器挤入到4%w/v的CaCl2溶液中，冰浴， 边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球;将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化11-13h， 用无菌水清洗小球，再放入饱和硼酸溶液中，于4℃冰箱中交联固化11-13h，用生理盐水洗 涤2-3次备用。
将A、B、C三步制得的好氧反硝化细菌小球从冰箱中取出，用双蒸水或者0.9%w/v的 生理盐水洗涤3-4次，然后浸泡在0.9%的生理盐水中，曝气约11-13h左右以活化固定化小 球，将一定量活化后的固定化小球填充到人工湿地模拟柱中，进行废水脱氮处理研究。
(3)于天然湖水中加入适量外加碳源柠檬酸钠，将经24h活化的施氏假单胞菌JH-1 按5%的接种量接入湖水中，摇床(30℃，120rpm)培养48h测定水体中硝态氮以及亚硝 态氮的量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果
本发明菌株可利用的碳源和氮源范围广泛，易于培养。
本发明菌株可用于处理高NO3-的废水，最高去除率可达99.6%，且无亚硝态氮的累积。
本发明菌株可同时去除有机废水中的COD，去除率可达60%-80%。
本发明菌株可以单独使用或者固定化后应用于废水处理中，应用广泛。
相比其他已发现的好氧反硝化细菌，菌株JH-1是一株非常高效的好氧反硝化细菌，24h 后对硝态氮的去除率可达99.6%，脱氮速率可达22.6mg·L-1·h-1，已报道分离出的好氧反硝化 菌其脱氮速率大多数在4.50～13.7mg·L-1·h-1。JH-1脱氮速率是这些菌的1.51～4.57倍。